生物素标记探针凭借其卓越的信号放大能力、多样化的检测手段、良好的稳定性以及较高的性价比，在多种核酸分子杂交实验中得到了广泛应用。其基于生物素-链霉亲和素系统的检测体系，已成为分子生物学中一项经典且成熟的检测系统之一。

本文围绕生物素标记探针的合成及其在不同分子杂交实验中的检测策略，对关键实验技术要点进行系统梳理与总结。

一、生物素标记探针的制备

依据核酸类型差异，生物素标记探针主要分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。其中，生物素标记的寡核苷酸探针通常需委托专业生物技术公司通过化学合成方法制备。研究者可自主制备的主要为DNA探针与RNA探针。

1. DNA探针的制备

生物素标记DNA探针常采用PCR法合成，即在PCR反应体系中引入一定比例的Biotin-11-dUTP与常规dNTP的混合底物，从而扩增获得标记生物素的双链DNA探针。该方法制备的探针稳定性高，易于长期保存，但在杂交效率与检测灵敏度方面通常低于RNA探针，RNA探针的灵敏度可高出DNA探针10倍以上，因此，更多的研究者会更偏向于使用生物素标记的RNA探针。

2. RNA探针的制备

生物素标记RNA探针主要通过体外转录法制备。推荐选用基于T7 RNA聚合酶的体外转录试剂盒，该酶在转录效率及产物产量上普遍优于SP6 RNA聚合酶，相关试剂盒品牌有百代生物BIOG、赛默飞Thermo Fisher和罗氏Roche等。但各厂家T7 RNA聚合酶的活性存在差异，例如Thermo Fisher试剂盒单次反应可合成2–6 ug探针，而BIOG试剂盒可达6–10 ug，推测可能与后者采用基因工程改造的高活性酶有关，研究者可根据产量需求进行选择。

此外，研究者还需特别关注试剂盒的反应体系能否支持掺入更多比例的生物素标记，这点容易被忽略，但却十分重要，标记核苷酸掺入比例越高，RNA探针活性就越高，检测灵敏度也就随之越高。但跟DNA探针合成不同的是，在RNA探针合成中使用Biotin-16-UTP的效果将优于Biotin-11-UTP。Biotin-16-UTP具有更长的连接臂，有助于优化生物素分子的空间暴露，降低位阻效应，提高RNA聚合酶的掺入效率，从而获得标记密度更高的探针；同时，其稳定性更强，可减少实验过程中标记脱落的风险。我们实验室曾开展相关灵敏度验证实验，结果表明，采用Biotin-16-UTP标记的RNA探针，最低可检测至0.16 ng的目标产物。

二、生物素标记探针的检测

生物素标记探针的检测主要依赖于生物素与（链霉）亲和素之间高亲和力、高特异性的结合作用。针对不同的核酸杂交类型，可采用多样化的检测终点以满足各类实验需求：

1. 膜杂交实验

在Southern blot、Northern blot及斑点杂交等膜杂交实验中，化学发光法为常用的检测手段。杂交后，采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素与膜上生物素标记探针结合，随后利用ECL化学发光底物进行信号检测。若目标分子丰度极低，建议选择配置有超敏飞克极别化学发光液的生物素标记核酸检测试剂盒，像BIOG、Roche等，其检测灵敏度较普通ECL配方要高出10倍以上，即使是极微量的目标分子也可检出。

2. 原位杂交实验

在显色原位杂交中，杂交后通过碱性磷酸酶（AKP）或HRP标记的亲和素与探针结合，再经NBT/BCIP（产生蓝紫色沉淀）或DAB（产生棕色沉淀）进行显色检测。

此外，生物素标记探针也广泛应用于荧光原位杂交（FISH）。通过孵育荧光素标记的亲和素（如Cy3-Avidin、FITC-Avidin、DyLight 488-Avidin、DyLight 594-Avidin等），可在激发光作用下发射特定波长荧光，借助荧光显微镜或激光共聚焦扫描仪直接观察信号分布。该方法具备信号级联放大效应，有助于提高检测灵敏度，尤其适用于低丰度或难检靶点。同时，由于可选择的荧光素-亲和素组合远比直接标记探针的荧光素种类丰富，生物素标记探针也为多色FISH实验提供了更大的灵活性，有助于提升整体检测性能。目前市场上此类FISH试剂盒可供选择的品牌有限，建议优先考虑如百代生物等在该领域具有技术优势的供应商，其产品性能稳定，且使用该试剂盒，研究者可省去繁琐的预杂交步骤，实验流程更简便的同时实验效率也能得到显著提升！