✅布板➕体系计算 我的经验是横排加同一种样品cDNA，竖排加同一种引物，这样不管加样和数据分析都很方便；设计好布板顺序后计算（如图2-3），一般多计算2个孔的量～ ✅加样 将引物mix和cDNA按顺序排好，准备好组里最精准的枪，先加9μLmix（加在靠管底的侧壁），再加1μLcDNA（加在靠管口的侧壁）；加样时吸一打二或吸二打一都可以，两种我都试过，误差都很小，如果枪不好用（打不干净液体），建议吸二打一 ✅上机➕下机数据分析 PCR反应条件要按照试剂说明书设置，每个牌子的反应条件不一样；下机后第一件事就是看溶解曲线及扩增曲线是否正常，熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，正常的扩增曲线一般呈光滑的S型，有基线期、对数期及平台期（如图7） ✅注意事项➕小tips 1. cDNA原液需稀释后用于实时定量PCR，稀释是为了避免逆转录缓冲液对qPCR体系的抑制干扰,稀释倍数建议至少5倍 2.引物溶解好后，正反引物可以1：1混合好，实验时更方便～ 3.加样时如图5，这样不用换枪头，同一引物和同一样品可以一根枪头搞定😎避免浪费也省时间